Validação Analítica conforme RDC 166 - Entendendo cada figura de mérito.

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15 DEC 2020

Validação Analítica conforme RDC 166 - Entendendo cada figura de mérito.

O desenvolvimento de novas metodologias analíticas é algo rotineiro nas indústrias farmacêuticas, porém, desenvolver um método não é suficiente se não houver comprovação da eficiência do mesmo, surgindo assim, a etapa de validação da metodologia. A normativa RDC 166 publicada em 2017 pela ANVISA aborda sobre os critérios para validação empregados em insumos farmacêuticos, medicamentos e produtos biológicos em todas as suas fases de produção.

Os critérios para aceitação e os parâmetros de validação de um novo método analítico envolvem a garantia de que os resultados apresentados por este método são confiáveis e reprodutíveis. Eles são estabelecidos de acordo com as características do analito e natureza do método, como preconiza a RDC 166. 
A validação consiste na análise crítica dos resultados obtidos para os testes que serão realizados e analisados estatisticamente, ou seja, as chamadas figuras de mérito. Para auxiliar nos procedimentos de análise estatística que devem ser realizados em relação à linearidade e ao efeito matriz, a ANVISA lançou o Guia n°10 em 2017 o qual traz modelos e formas de realizar o tratamento estatístico.
 
Caso os resultados estejam dentro das faixas esperadas e os testes executados conforme determina a normativa, o método será considerado confiável e, portanto, estará validado. Cabe ressaltar que nem sempre será necessária a realização de todos os testes, isto irá depender do objetivo da metodologia proposta. Para saber quais são os testes obrigatórios basta consultar os anexos da normativa. Seguem abaixo de forma concisa as figuras de méritos que a normativa apresenta e uma breve descrição do que se trata.

Seletividade
No teste de seletividade é necessário comprovar que o resultado do método representa apenas o analito de interesse e não possui interferentes, ou seja, que o método proposto consegue quantificar seu ativo alvo de maneira exata e precisa mesmo na presença de outros compostos presentes na amostra. Em alguns casos, é necessária a combinação com outros métodos analíticos de identificação a fim de se obter o nível de seletividade necessário.

Linearidade
No teste de linearidade é necessário comprovar que os resultados analíticos são diretamente proporcionais à variação da concentração do analito, resultando em uma relação linear que deve ser avaliada em toda faixa estabelecida para o método. Utilizando estes resultados, um modelo matemático linear deve ser construído e devem ser analisados os parâmetros da reta obtida no que diz respeito aos coeficientes angular, linear, de correlação e de determinação. Cabe ressaltar, que antes de qualquer tratamento estatístico é necessária uma análise visual para verificar se os pontos possuem relação linear aparente. Deve ser garantido que os resíduos apresentem independência, normalidade e homocedasticidade. Demais testes estatísticos que devem ser realizados são descritos no Guia 10 de 2017. Segundo a normativa, para realização do teste, devem-se utilizar no mínimo cinco concentrações distintas, em no mínimo triplicata, ou seja, três curvas analíticas preparadas de forma independente. 

Efeito Matriz
O teste de efeito matriz é aplicável para matrizes complexas, ou seja, matrizes que apresentam número indefinido de compostos não monitorados. Para verificar se o efeito matriz é significativo para a análise em questão é necessário comparar o coeficiente angular da curva analítica obtida para o ativo em solvente com o coeficiente angular da curva analítica em extrato. Diferenças expressivas entre os coeficientes angulares obtidos indicam a existência de efeito matriz.

Precisão
O teste de precisão busca verificar se a variância obtida para múltiplos testes realizados para uma amostra, de acordo com a forma de preparo descrita no método, encontra-se dentro dos critérios estabelecidos. A mesma deve ser expressa por meio da repetibilidade, da precisão intermediaria ou da reprodutibilidade. A forma de avaliação da precisão é através do DPR (desvio padrão relativo) da série de medições. A determinação da repetibilidade pode ser feita de duas formas distintas: preparar seis amostras independentes na concentração alvo do método ou nove preparos em três níveis contemplando o intervalo linear do método. A precisão intermediária consiste no preparo da amostra em dias diferentes por analistas diferentes e a avaliação da reprodutibilidade resulta na análise realizada por outro laboratório. 

Exatidão
A exatidão de um método é utilizada para verificar o grau de concordância entre o valor obtido e o valor considerado como verdadeiro (aceito). Assim, como nas outras figuras de mérito, o preparo das soluções deve ser realizado de forma independente, podendo ser diluídas de uma mesma solução mãe. Deve ser verificada a partir de nove determinações (três níveis, em triplicata) que contemple a faixa linear do método.

Faixa de Trabalho
Baseando-se nos resultados obtidos nos testes de linearidade, precisão e exatidão deve-se, então, definir a faixa de trabalho do método. A norma indica os níveis de concentração que devem ser utilizados na faixa de trabalho de acordo com o objetivo da metodologia proposta. 

Limite de Detecção
O limite de detecção consiste na menor quantidade do analito que é possível ser detectada, mas não necessariamente quantificado pelo método. Sua determinação pode ser realizada por método visual, razão sinal-ruído ou baseada na determinação do branco.

Limite de Quantificação
O limite de quantificação consiste na menor quantidade do analito que pode ser quantificado com reprodutibilidade de resultados e com confiabilidade pelo método. É esperada que a razão sinal-ruído seja de no mínimo 10:1 para definir o nível como o limite de quantificação.

Robustez
O teste de robustez é realizado para garantir que o método analítico proposto é eficiente e confiável mesmo que pequenas variações nas condições analíticas ocorram de forma aleatória. Essa figura de mérito geralmente é realizada no desenvolvimento analítico. Os parâmetros que devem ser avaliados são mostrados na Tabela 1 Anexo III da normativa RDC 166 e a ausência de qualquer um dos parâmetros propostos deve ser devidamente justificada. Os resultados obtidos para o método sem variação e com variações devem ser estatisticamente equivalentes para garantir que o método é robusto.

Método validado 
Uma vez realizadas as figuras de mérito necessárias para a validação do método analítico, a análise crítica dos resultados encontrados e os mesmos estando dentro dos critérios de aceitação, o método encontra-se validado.
Vale citar que em algumas circunstâncias, o método analítico precisará ser revalidado, como: alteração do método analítico, alteração na composição do produto, mudança na síntese do insumo farmacêutico ativo ou outras alterações que possam impactar significativamente no método validado.

Desta forma, podemos concluir que a validação analítica é de extrema importância para que se conheça as limitações das medidas realizadas no decorrer do método analítico. Uma vez o método analítico validado, temos a segurança acerca dos resultados emitidos, ou seja, atestamos a confiabilidade, eficácia e qualidade do método. 

Autor: Thamy Aruanne Silva Luiz